ARTIGO ABORDANDO O TEMA: GENÉTICA E MELHORAMENTO DE PLANTAS
Uso prático de
marcadores moleculares para seleção assistida no melhoramento de uvas de mesa
apirênicas
Autores: Luís Fernando Revers;
Vanessa Sawatzky Lampe; Paulo Ricardo Dias de Oliveira; Umberto Almeida
Camargo; Júlio César de Lima
RESUMO
A hipótese
mais bem aceita atualmente para explicar a genética complexa da
estenoespermocarpia, observada na videira, indica que a expressão deste
fenótipo é controlada por três genes recessivos, independentemente herdados e
controlados por um gene regulador dominante (sdI). Em estudo anterior,
Lahogue et al. (1998) identificaram um marcador RAPD (Random Amplified
Polymorphic DNA) ligado ao gene sdI e utilizaram-no para desenvolver um
SCAR (Sequence Characterized Amplified Region) co-dominante denominado SCC8,
que pode distinguir, em uma progênie, indivíduos com semente como também
selecionar indivíduos apirênicos. Neste trabalho, são apresentados resultados
da avaliação do potencial de aplicação do marcador molecular SCAR SCC8 para
seleção assistida do caráter da apirenia no melhoramento de uvas de mesa sem
sementes. A utilização deste marcador na seleção assistida para apirenia em
uvas de mesa mostrou-se viável, e as consequências da sua utilização no
programa de melhoramento da Embrapa Uva e Vinho são discutidas.
Termos para indexação: Vitis, marcador molecular, seleção assistida, apirenia.
INTRODUÇÃO
As condições
ambientais do trópico brasileiro, em suas diferentes regiões, possibilitam a
planificação da produção de uvas ao longo do ano, o que pode garantir oferta
permanente de uvas de boa qualidade, com ampla possibilidade de ocupar espaço
em períodos de desabastecimento no mercado internacional (abril-junho e
novembro-dezembro), quando os preços são particularmente atrativos (Leão,
2001). No ano de 2005, a uva ocupou o 2º lugar entre as frutas brasileiras mais
exportadas, apresentando o maior crescimento (171%) em relação ao ano de 2004
(Safra, 2005). Esse crescimento tem se dado em virtude da expansão da área de
cultivo de uvas apirênicas. Todavia, a utilização de cultivares de uva sem
sementes importadas, com dificuldades de adaptação, como é o caso de Thompson
Seedless, Superior Seedless, Crimson Seedless e outras, cuja produtividade é
baixa e inconstante, ainda limitam o crescimento das exportações brasileiras
frente à enorme demanda internacional por uvas sem sementes. Portanto, a falta
de cultivares apirênicas (uvas sem sementes) adaptadas às condições ambientais
do Brasil, além de limitar a capacidade de exportação, afeta a competitividade
da uva brasileira no mercado interno, aberto à comercialização de uvas
importadas (Protas et al., 2003).
Ao lançar as três
primeiras cultivares brasileiras de uva sem semente (BRS Clara, BRS Linda e BRS
Morena), a Embrapa Uva e Vinho deu um passo importante para assegurar a
competitividade, sustentabilidade e independência tecnológica da viticultura de
mesa nas regiões tropicais e subtropicais do Brasil (Camargo et al., 2003a, 2003b,
2003c). No entanto, a busca de novas cultivares com características agronômicas
que atendam às demandas da cadeia produtiva da viticultura brasileira, é um
desafio constante.
Na videira, a
ausência de sementes é resultante de dois processos biologicamente distintos:
partenocarpia ou estenoespermocarpia (Pratt, 1971). No processo de
estenoespermocarpia, predominantemente selecionado nos programas de
melhoramento de uvas de mesa, o desenvolvimento do embrião e do endosperma
inicia-se após a fertilização, mas os tecidos do endosperma degeneram
prematuramente, levando à produção de frutos contendo traços de sementes não
esclerificados. Cronologicamente, a degeneração do endosperma e a consequentemente
morte do embrião ocorrem de 3 a 6 semanas após a antese, e o embrião atinge, no
máximo, estágio globular (Pratt, 1971; Camargo et al., 1999). Apesar de
inúmeros esforços dos melhoristas nos últimos 70 anos, a herança da
estenoespermocarpia na videira ainda permanece pouco compreendida (revisão em
Stout, 1936; Bouquet & Danglot, 1996). Atualmente, a hipótese mais bem
aceita para explicar a genética complexa da estenoespermocarpia foi proposta
por Bouquet & Danglot (1996). Neste estudo, esses autores sugerem que a
expressão da característica é controlada por três genes recessivos herdados de
maneira independente e controlados por um gene regulador dominante. Lahogue et
al. (1998), aplicando a metodologia de BSA (Bulk segregant analysis),
identificaram um marcador RAPD ligado ao gene sdI (gene
regulador dominante do fenótipo da apirenia) que foi utilizado para o
desenvolvimento de um SCAR co-dominante denominado SCC8. Segundo estes autores,
o marcador co-dominante SCC8 pode distinguir, em uma progênie segregante,
indivíduos com semente de indivíduos apirênicos.
Neste trabalho,
apresentam-se resultados que corroboram a hipótese da herança da apirenia
estenoespermocárpica proposta por Bouquet & Danglot (1996) e que avaliam o
potencial da aplicação do marcador molecular SCAR SCC8 para a seleção assistida
do caráter da apirenia no programa de melhoramento da Embrapa Uva e Vinho.
MATERIAL E MÉTODOS
Material Vegetal: os genótipos de videira utilizados
neste trabalho são resultantes do cruzamento CNPUV154, entre as cultivares
Seyve Villard 12327 (com semente) e CG87746 (apirênica); do cruzamento
CNPUV692, entre as cultivares Seyve Villard 12375 (com semente) e Crimson
Seedless (apirênica); de seleções apirênicas do programa de melhoramento da
Embrapa Uva e Vinho (BRS Morena, BRS Clara, BRS Linda e Seleções 3; 5; 6 e 8) e
de cultivares de uva de mesa apirênicas (Canadice, Flame Seedless, Reliance,
Ruby Seedless, Muscat Seedless, Autumm Royal, Fantasy, Superior Seedless, Red
Seedless, Maroo Seedless, Perlette, Crimson Seedless, Saturn, Centennial
Seedless e Thompson Seedless), totalizando 140 plantas (Tabelas 1 e 2). Os critérios de classificação fenotípica descritos por Lahogue
et al. (1998) foram utilizados para a definição das categorias fenotípicas de
classificação da apirenia (% matéria seca de sementes e sementes-traço):
%MS >55%: classe 1 – semente normal; %MS<55 e >45%:
classe 2 – traço de semente grande; %MS <45 e >35%: classe 3
– traço de semente perceptível; %MS <35%: classe 4 – ausência de semente).
Extração de DNA: amostras de folhas expandidas jovens
foram coletadas durante a estação de crescimento e armazenadas a - 20°C para
posterior extração de DNA, utilizando-se do método descrito por Lefort &
Douglas (1999), com modificações no tampão de extração (50mM Tris HCl pH 8,0;
20mM EDTA pH 8,0; 1,1M NaCl; 0,4M LiCl; 1% CTAB; 2% PVP40 e 0,5% Tween 20).
Preparo da PCR: 9 ng de DNA total, 250µM dNTPs
(2'-deoxinucleosideos 5'-trifosfatos – Invitrogen), DMSO (Biosolv Ltd –
Holanda) 5%, 10pMoles de cada iniciador (descritos por Lahogue et al., 1998 -
SCC8F 5'GGTGTCAAGTTGGAAGATGG3' e SCC8R 5'TATGCCAAA-AACATCCCC3'; sintetizados
por Alpha DNA – Quèbec, Canadá), 0,5U de Tth DNA polimerase (Biotools –
Espanha) e tampão na concentração indicada pelo fabricante. O volume final da
reação (20 µl) foi ajustado com água ultrapura. O programa utilizado no
termociclador foi: 94°C por 4 min, 35 ciclos de amplificação (94°C por 1 min,
60°C por 1 min e 72°C por 1 min) e extensão final a 72°C por 6 min. Indivíduos
que não apresentaram produto de amplificação na reação com SCC8F e SCC8R, foram
reavaliados utilizando-se, pelo menos, de outras duas amostras de DNA total
independentes para confirmar a ausência do marcador no lócus SCC8.
Digestão do produto de amplificação: o produto de
amplificação da reação do lócus SCC8 (1011pb) foi digerido em uma reação com
volume final de 15 µl, utilizando-se 7 µl da reação de PCR e 2,5 U da
endonuclease de restrição Bgl II (MBI Fermentas – Lituânia)
durante 7 h a 37ºC.
Eletroforese e fotodocumentação: os produtos da amplificação foram
resolvidos em gel de agarose (GIBCO BRL – New York) 1,5 ou 2%, contendo brometo
de etídio (0,5 ìg/ml) e fotodocumentados com auxílio do sistema Eagle Eye – II
Still Video System (Stratagene).
Comprimento dos fragmentos: o tamanho dos fragmentos (número de
pares de base – pb) resultantes das reações de PCR e digestão foram estimados
utilizando-se do software DNASIZE (Raghava, 1994).
Análise estatística: o marcador SCAR SCC8 foi avaliado
para presença (1) ou ausência (0) em todo o material vegetal. Na avaliação da
segregação fenotípica para apirenia, as classes 2; 3 e 4 foram
consideradas apirênicas, conforme sugerido por Lahogue et al. (1998). Desvios
entre as segregações observadas e esperadas para o lócus SCC8 foram
testadas pelo teste c2. Análise de correlação (r) foi utilizada
para avaliar a associação entre SCC8 e apirenia.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
A característica
co-dominante do marcador SCC8 permitiu a diagnose de 3 alelos no
lócus SCC8 (SCC8: 1011pb;scc8: 669pb+342pb após
digestão com Bgl II e 0: alelo nulo –
não-amplificação) (Figura 1 e Tabela 1) e 4 genótipos segregantes (SCC8/0; SCC8/scc8; scc8/0 e 0/0),
indicando que ambos os genitores do cruzamento CNPUV692 (Crimson Seedless e
Seyve Villard 12375) são heterozigotos para o lócus SCC8. O teste
de independência c2 mostrou que a segregação genotípica
observada para o lócus SCC8 na população CNPUV692 não desvia
significativamente da segregação esperada 1:1:1:1 (c2calc=
3,53; p= 0,05). A análise de correlação entre as classes
fenotípicas observadas e a presença do alelo SCC8 confirmou a
associação entre esse alelo e a ausência de sementes (rcalc=
0,66; p= 0,01) (Figura 2), confirmando os relatos de Lahogue et al. (1998) e Adam-Blondon et al.
(2001). A
classificação fenotípica para apirenia, adotando-se o percentual médio de
matéria seca das sementes, também revela que a cultivar Crimson Seedless não é
um bom genótipo doador de apirenia, pois além de ser heterozigota para o lócus SCC8 (SCC8/0)
(Figura 1), nenhum
indivíduo classe 4 (%MS <35%) foi identificado na população CNPUV692 (Tabela 1). Adicionalmente, o teste de independência c2 mostrou
que a distribuição fenotípica não desviou da segregação esperada de 1:1
(apirenia:pirenia; c2calc= 0,38; p= 0,005) no
lócus SCC8 na população CNPUV692, sustentando a hipótese
proposta por Bouquet & Danglot (1996) para a herança da estenoespermocarpia
na videira. Para ampliar o espectro do estudo e avaliar se a mesma associação
entre a apirenia e a presença de SCC8 ocorre em outras
populações, o mesmo procedimento foi aplicado para avaliar híbridos com e sem
semente resultantes do cruzamento CNPUV154, seleções apirênicas e cultivares de
uva sem sementes já utilizadas comercialmente (Tabela 2). Após a diagnose dos alelos, observou-se que, entre os híbridos da
população CNPUV154, a análise de correlação indicou associação entre a presença
de SCC8 e a ausência de sementes (rcalc= 0,74; p=
0,01). Entretanto, observam-se, no grupo de plantas com semente da população
CNPUV154, dois indivíduos que podem representar recombinantes (GS48 e GS114),
pois possuem o alelo SCC8 e apresentam semente normal. Nos estudos
preliminares desenvolvidos por Lahogue et al. (1998) e Adam-Blondon et al.
(2001), a distância estimada entre o gene sdl e o
marcador SCC8 foi de 0,7 cM e 4,0 cM, respectivamente.
Isto pode explicar a ocorrência de recombinantes na população CNPUV154.
Nos demais genótipos apirênicos, incluindo-se cultivares e seleções avançadas
do programa de melhoramento da Embrapa Uva e Vinho, a presença de SCC8 ocorreu
em todos os casos, indicando o potencial de distinção fenotípica deste
marcador. Esta observação reforça o caráter de inespecificidade populacional do
marcador SCC8 sugerido por Lahogue et al. (1998).
Com essa metodologia, o custo
total da reação, utilizando-se do SCAR SCC8, foi de aproximadamente R$ 4,35 por
planta. Comparando-se a estimativa de custo da seleção assistida com a do
melhoramento genético convencional, estimada em R$ 7,50 por planta (correspondendo
somente à instalação e manutenção de campos de seleção de híbridos), a
utilização do marcador SCC8 representa uma alternativa viável não somente para
seleção precoce de genótipos apirênicos, mas também para a economia de insumos,
visto que os custos poderão ser sensivelmente.
CONCLUSÃO
A utilização do
marcador molecular SCC8 para seleção assistida da ausência de sementes na
videira e na avaliação da herança da reduzidos ao evitar-se levar ao campo
plantas com sementes, que serão avaliadas, no sistema convencional, somente
após o primeiro ano de produção .estenoespermocarpia foi testada em duas
populações segregantes do programa de melhoramento da Embrapa Uva e Vinho
(CNPUV692 e CNPUV154), em seleções avançadas e em cultivares de uva sem
sementes já utilizadas comercialmente. Os resultados obtidos confirmaram que o marcador
SCC8 parece estar suficientemente próximo do gene sdl para
permitir a sua utilização em uma estratégia de seleção assistida por marcadores
moleculares, possuindo, no estudo apresentado, uma eficiência aproximada de 80%
na diagnose do caráter da apirenia. Adicionalmente, a
validação deste marcador em populações diferentes da qual foi desenvolvido
confirma o caráter de inespecificidade populacional do mesmo e amplia a
possibilidade de sua utilização para seleção assistida da ausência de sementes
na videira.
A utilização do marcador SCC8
para seleção assistida da ausência de sementes é inédita em programas de
melhoramento de uvas de mesa no Brasil, e a sua implementação em maior escala
deverá contribuir para economia de tempo e insumos no desenvolvimento de
cultivares de uvas sem sementes. Além disso, por se tratar de um marcador
co-dominante, a sua utilização permite detectar genitores heterozigotos,
possibilitando, assim, a seleção de genitores homozigotos para o caráter da
apirenia no planejamento de cruzamentos.
Disponível em: <http://www.scielo.br/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0100-29452006000100029&lng=pt&nrm=iso&tlng=pt>.
Acesso em: 16/07/2013
RESENHA
CRÍTICA SOBRE ARTIGO
O Artigo analisado
cujo titulo é “Uso
prático de marcadores moleculares para seleção assistida no melhoramento de
uvas de mesa apirênicas” aborda o tema relacionado ao melhoramento genético de
uvas com a finalidade de produzir grande quantidade desse espécime de planta na
forma apirênica, ou seja, que não tenham a presença de sementes tornando, dessa
forma, o produto mais valorizado no mercado internacional aumentando as
exportações brasileiras nesse ramo.
Os autores da pesquisa em questão justificam seu
interesse e consequentemente o investimento requerido para a elaboração da
mesma levando em conta dados e estatísticas que demonstram a realidade da
planificação da produção de uvas brasileiras onde são constatados que ocorreu
nos últimos anos crescimento da exportação de uvas nacionais em detrimento do
cultivo apirênico dessa espécie, porém a utilização de cultivares de uvas sem
sementes importadas apresenta dificuldades de adaptação ao clima tropical sendo
necessário a utilização de procedimentos, que levam em conta conceitos
genéticos, para a elaboração de uma espécie cujo genótipo esteja de acordo aos
padrões nacionais se desenvolvendo com lucratividade no país.
Para atingirem seus objetivos os pesquisadores utilizam
como base teórica o processo de estenoespermocarpia que leva a produção de
frutos contendo traços de sementes que não apresentam especificidade sendo
assim quase imperceptíveis, eles compreendem esse processo levando em conta a
hipótese proposta por Bouquet e Danglot, em que é sugerido que o controle
genético desse processo se dá por três genes recessivos herdados de
maneira independente e controlados por um gene regulador dominante.
Utilizando esse e outros dados relevantes eles desenvolvem um marcador
co-dominante o SCC8 que segundo suas analises pode distinguir, em uma progênie
segregante, indivíduos com semente de indivíduos apirênicos, levantando a tese
de que a herança apirenia está interligada a estenoespermocárpica e que com a
utilização desse marcado é possível à controlar e utilizá-la no cultivo de
uvas.
Os resultados obtidos
através da análise entre as classes fenotípicas observadas e a presença do
alelo SCC8 confirma a associação entre esse alelo e a ausência de sementes, os
pesquisadores comprovam ainda que a utilização do marcador representa uma
alternativa viável não somente para a seleção precoce de genótipos apirênicos,
mas também para a economia de insumos, visto que os custos relacionados à mesma
são supridos pela produção adquirida deixando uma margem de lucro satisfatória.
Além
disso, por se tratar de um marcador co-dominante, a sua utilização permite
detectar genitores heterozigotos, possibilitando, assim, a seleção de genitores
homozigotos para o caráter da apirenia no planejamento de cruzamentos.
Em suma, verifica-se com esse
artigo que a utilização do marcador SCC8 para seleção assistida da ausência de
sementes deverá contribuir para o desenvolvimento de cultivares de uvas sem
sementes no território brasileiro, o mesmo possibilita a seus leitores um maior
entendimento sobre genética permitindo a ampliação de conhecimentos sobre o
tema, sendo assim recomendado para a leitura e analise a fim de compreender
melhor o processo utilizado.
